澳银INSIGHTS|解锁生命密码，探索RNA疗法的无限可能
Figure 1：Katalin Karikó和Drew Weissman获得“2023年诺贝尔生理学或医学奖”。Source：诺奖官网
2023年10月2日，瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院（Karolinska Institute）的诺贝尔大会宣布，将2023年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家卡塔林·卡里科（Katalin Karikó）和德鲁·魏斯曼（Drew Weissman），因为发现了核苷酸基修饰而开发出有效的抗COVID-19 mRNA疫苗。Kariko和Weissmann开创性的发现了mRNA碱基修饰的重要性，使得mRNA疗法得以迅速应用至临床，根本上改变了对 mRNA 与免疫系统相互作用之间的理解。在现代人类健康面临的最大威胁之一期间，以前所未有的速度（从开发到上市仅用了一年时间）为疫苗研发做出贡献。因此将大众的视线再次聚焦到RNA疗法，一种极具潜力的治疗手段，目前正被广泛的开发和临床应用。而此前2006年，RNAi的两位先驱Andrew Fire和Craig Mello因1998年发表论文，确定双链RNA (dsRNA)是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)转录后基因沉默(PTGS)的病原体，这种现象称为RNA干扰(RNA interference, RNAi)而获得了诺贝尔生理学或医学奖。
RNA疗法是一种基于RNA水平的治疗方法，通过碱基配对与mRNA结合而影响mRNA的代谢过程（包括从前体mRNAs开始的剪接、mRNAs的运输、翻译和降解）。近10年来，RNA治疗在许多重要领域高度活跃，已成为治疗领域的研究热点。
图片来源：https://www.smgconferences.com/pharmaceuticals/uk/conference/rna-therapeutics
正文
众所周知，脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）是生物细胞遗传物质的载体。在细胞中，根据中心法则DNA被转录成信使核糖核酸，而信使核糖核酸又被翻译成蛋白质，而蛋白质在调节生命活动中起着至关重要的作用。伴随分子生物学的快速发展，一些核酸被研究发现具有调控作用，例如：启动子、增强子、核酶、mRNA、miRNA、siRNA等。针对不同类别功能、作用机制进行的核酸新药研发日益成为当前新药开发的热门赛道。
与传统小分子化学药物和抗体类药物不同，核酸药物高度以来碱基互补配对原则参与基因转录和翻译的过程，可高效特异性调控致病靶基因或靶RNA。此外，核酸药物具有治疗效率高、药物毒性小、特异性强、应用领域广泛等优势，有望成为在小分子化药、抗体后出现的第三类重磅药物，具有广阔的研发和应用前景。
与基于DNA的疗法相比，基于RNA的疗法因其独特的理化性质和特征更具前瞻性。RNA可在DNA、RNA、蛋白质，三种生物大分子中发挥作用。RNA分子（例如：ASO、siRNA、miRNA）可直接通过碱基互补配对靶向mRNA和ncRNA。理论上说，RNA可通过选择正确的核苷酸序列靶向任何基因。人类基因组中大多DNA序列都已完成了非编码转录被，而已获批的蛋白质水平的靶向疗法（即小分子化药和抗体药物）只能对0.05%的人类基因组进行药物治疗。85%的蛋白质不能和小分子化药进行靶向结合。体外转录（IVT）mRNA可在进入细胞质后用于蛋白质替代治疗或免疫，并不会像DNA疗法那样发生不可逆转的基因组变化、诱发遗传风险。此外，通过CRISPR基因组编辑可以直接修改目标RNA序列治疗特定疾病。RNA aptamers可阻断蛋白质活性，作用过程类似小分子抑制剂和抗体。因此，RNA疗法可以拓宽药物靶点的范围这一优势，使得其成为最具吸引力的治疗方式。
关于RNA疗法的基础研发最早可追溯至1956年（Figure 1），Rich和Davies发表了第一个核酸杂交反应，证明RNA可以基于其碱基配对中的相同互补性形成与DNA相似的构型。这一发现为随后1993年发现miRNA（micro RNA）和1998年发现RNA interference奠定了基础，并指出RNA双链体的产生是RNA沉默的关键步骤。
1998年首款基于RNA疗法的药物Vitravene (Fomivirsen)中文名福米韦生，是FDA批准上市的第一个反义寡核苷酸类药物，于1999年获得EMA批准上市，由Isis Pharmaceuticals和Novartis联合研发。该药物由21个硫代脱氧核苷酸组成，主要用于治疗艾滋病(AIDS)病人并发的巨细胞病毒(CMV)性视网膜炎。通过对人类巨细胞病毒(CMV) mRNA的反义抑制发挥特异抗病毒作用；疗效维持久，给药次数少，不良反应轻。上市初期，市场对于抗巨细胞病毒药物的需求甚为迫切；随后由于高活性抗逆转录病毒疗法的发展，巨细胞病毒病例数量急剧下降。该药在欧洲和美国分别于2002年和2006年退市。
Figure 1. The historical timeline of important discoveries in RNA biology and key developments in RNA therapy. Source: Kim YK. RNA therapy: rich history, various applications and unlimited future prospects. Exp Mol Med. 2022 Apr;54(4):455-465. doi: 10.1038/s12276-022-00757-5. Epub 2022 Apr 19. PMID: 35440755; PMCID: PMC9016686.
RNA大分子具有很多功能，可以简单分为coding或messenger RNA（mRNA）和non-coding RNA（ncRNA）。
【而ncRNA包括ribosomal RNA（rRNA）、transfer RNA（tRNA）、small nuclear（snRNA）、small nucleolar RNA（snoRNA）、long non-coding RNA（lncRNA）、short hairpin RNA（shRNA）、micro-RNA（miRNA）、transfer messenger RNA（tmRNA）、small interfering RNA（siRNA）、small activating RNA（saRNA）、piwi-interacting RNA（piRNA）、circular RNA（circRNA）、ribozymes和exosomal RNA。】
细胞内具体的位置和不同类型的RNA详见Figure 2.
Figure 2 .Types of naturally occurring RNA and their cellular functions and localizations. Source：Sasso JM, Ambrose BJB, Tenchov R, Datta RS, Basel MT, DeLong RK, Zhou QA. The Progress and Promise of RNA Medicine─An Arsenal of Targeted Treatments. J Med Chem. 2022 May 26;65(10):6975-7015. doi: 10.1021/acs.jmedchem.2c00024. Epub 2022 May 9. PMID: 35533054; PMCID: PMC9115888.
RNA疗法的工作方式如下图所示，作用机理主要是通过寡核苷酸与mRNA通过碱基互补配对原则结合，进而干扰影响mRNA的代谢过程实现治疗目的。
Figure 3. Mechanisms of RNA therapeutics.Source：Liang X, Li D, Leng S, Zhu X. RNA-based pharmacotherapy for tumors: From bench to clinic and back. Biomed Pharmacother. 2020 May;125:109997. doi: 10.1016/j.biopha.2020.109997. Epub 2020 Feb 13. PMID: 32062550.
（A）反义miRNA与目标miRNA的活性链互补，从而削弱内源性miRNAs的基因沉默效应，进而促进蛋白质的表达。
（B）增强内源性miRNAs的功能，减少细胞内蛋白的表达。
（C）阻断miRNA激动剂其被用来阻止RISC与特定的mRNAs结合，从而“阻断”miRNA结合部位，以增加相关蛋白质的表达。
通常，RNA疗法是通过利用细胞内的RNase H(G)或形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)(D、E1、E2)来切割靶基因。在植物细胞中，miRNA与目标mRNA完全结合以降解(E1)，而在动物细胞中，因其不能与其目标mRNA互补，后者阻止核糖体并减少翻译(E2)。ASO能够调节mRNA(F)的剪接过程。它通过与异常的mRNA剪接位点结合来纠正错误的剪接。
而根据不同类型的RNA药物，下表展示了几种其具体的作用机制和作用靶点。
Chart 1：RNA药物种类及作用机制。Source：裴佳伟，王雪，黄倩，谭慎行，田野*，骞爱荣*. 小RNA合成技术与小RNA药物研究进展.
陕西师范大学学报(自然科学版). 2023, 51(3): 1-15 https://doi.org/10.15983/j.cnki.jsnu.2023201
由此，RNA疗法的研发主要聚焦在两方面：一是反义RNA（antisense RNA），短寡核苷酸识别并与内源性RNA转录本中的互补序列杂交，从而进行改变。二是信使RNA（mRNA，messenger RNA），其编码某些肽或蛋白质的mRNA在细胞质中引发其短暂表达（例如，用于替代缺陷蛋白或提供疫苗抗原）。
Figure 4. Schematic illustrating different classes of RNA therapeutics. ASO, antisense oligonucleotide; RNA, ribonucleic acid; RNAi, RNA interference; siRNA,
small interfering RNA; miRNA, microRNA; mRNA, messenger RNA; A, adenosine molecule; AAAAA, poly A tail. Source: Damase TR, Sukhovershin R, Boada C, Taraballi F, Pettigrew RI, Cooke JP. The Limitless Future of RNA Therapeutics. Front Bioeng Biotechnol. 2021 Mar 18;9:628137. doi: 10.3389/fbioe.2021.628137. PMID: 33816449; PMCID: PMC8012680.
伴随RNA生物学、生物信息学的发展，促使了RNA疗法的快速发展，并展现了如下驱动其快速发展的优势，诸如：RNA疗法具有可针对小分子化药不能靶向的靶点进行结合；与小分子和重组蛋白相比，可快速成本低廉的方式进行研发；可快速改变mRNA的结构序列用于个人精准化治疗适应不断变化更新的病原体。
-①-
RNA疗法
5大优势归纳
-②-
RNA疗法的几种类型
将其分为4种类型的疗法进行详细描述
已上市药物详见图表：
全球已上市及申请上市的RNA药物
Chart 2：全球已上市及申请上市的RNA药物。
Source：智慧芽数据库，数据截止：2023年9月28日。
RNA疗法的研发生产一般流程为：测序、靶点确定、序列设计和优化、递送技术研究、核酸合成、纯化、制剂及生产等。在研发过程主要需要克服以下三方面的障碍：
（1）组织中广泛存在的核酸酶会快速降解外源RNA；（2）将带负电的RNA传递通过疏水性的细胞膜；（3）外源RNA具有强烈的免疫原性，会导致细胞毒性并损害影响其翻译转化为治疗性蛋白质。
根据沙利文2022年5月发表的报告提到，小核酸药物（即本文所指ASO、siRNA、miRNA、Aptamer）研发过程中，在药效学、药代动力学、CMC、递送等方面遇到瓶颈。包括：递送效率低、靶向性差、脱靶毒性、免疫介导毒性、组织/细胞穿透性低、化学修饰方法严格、规模化生产难度高。对于mRNA产品研发，仍需解决mRNA设计方面的序列优化和核苷修饰技术的优化、提高体内表达蛋白质效率、高效安全递送、提高mRNA纯度、确保颗粒大小一致性、提高大规模生产时的包封效率，确保产品稳定并降低成本等。
针对研发过程中遇到的问题，需要以相应的技术路径解决。
在设计方面，需要准确获取致病基因的功能信息，有针对性的进行序列设计；在修饰方面，利用特定化学修饰方法优化结构，提高血清稳定性、降低毒性；
在合成方面，针对市场潜力大的产品进行液相合成技术研究，发展小核酸单体合成技术和发酵技术，保证产品质量并实现商业化收益；在制剂方面，通过复合药物开发、沉默多个信号通路的靶点，实现多靶点调控，提升药物疗效。
Figure 7.小核酸药物核心研发技术挑战。Source：沙利文：核酸药物市场产业现状与未来发展报告。
值得一提的是，核酸设计和制备工艺目前相对成熟，而向人体各组织细胞中递送药物是发挥其治疗功能的关键，也是RNA疗法面临的技术难点之一。目前递送过程中主要存在的难点包括：（1）核酸不稳定性，易于被血浆、组织中核糖核酸酶降解，被肝脏和肾脏快速清除；
（2）核酸自身免疫原性易被免疫系统识别；（3）药物靶向性差；
（4）核酸分子量大且带负电荷使其不易跨过细胞膜进入细胞质；
（5）在体内无法释放。针对上述这些难点，RNA疗法将重点聚焦了核酸分子改造、药物递送载体、偶联技术等方向的研究并提供多种解决思路。
对核酸分子进行改造，包括mRNA结构元件的设计和核酸分子的化学修饰两种方式，从而提高其稳定性增加翻译效率，延长半衰期。例如首个上市ASO药物Fomivirsen就是采用的硫代磷酸酯进行修饰。Alnylam公司开发的siRNA药物GIvosiran采用了核糖修饰的方法。药物递送以脂质体为代表应用为代表，其中尤以脂质纳米粒（LNP）最为受到头部公司诸如Moderna、Curevac公司应用最为广泛。但LNP递送存在一些缺点，例如mRNA递送时体内逃逸率低、LNP分子量大易引起过敏反应、LNP递送通常靶向肝脏限制适用范围、LNP易氧化降解、制备重现率差等。因此斯微生物采用了LPP等不同材料进行递送、此外外泌体递送因无免疫排斥、能够穿透血脑屏障的优势具有极大的应用潜力。采用生物偶联技术可促进细胞摄取、增强传递效率。主要应用N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）与肝脏细胞表面去唾液核糖蛋白受体结合，通过与小核酸药物形成缀合物，实现药物靶向递送并迅速内化，大幅度提升药物安全性、减少脱靶效应增强药效。2019年获批的Givlaari是首个使用GalNAc递送技术上市的RNA疗法药物。
基于RNA疗法的用药优势和广泛应用前景，近年来资本的关注，根据Nature发表的《RNA therapeutics on the rise》文章中提到RNA疗法相关公司融资额近年来迅速增加。2015年至2020年，上市寡核苷酸公司市值增长94.2%。自2015年以来，三家具有代表性的mRNA治疗公司（Moderna Therapeutics、BioNtech和CureVac）吸引了28亿美元的私人投资。其中Moderna创造了2018年规模最大的生物技术IPO，市值约为76亿美元。自2017年以来，RNA相关的小分子公司已经筹集了大量投资，包括那些直接针对RNA的公司（向Arrakis、Expansion、Skyhawk和Ribometrix提供了2.62亿美元资金），以及针对表位转录组学相关蛋白质的公司（向Accent、Storm、Gotham和Twentye-Seven Therapeutics提供了1.94亿美元资金）。
Figure 8. RNA疗法近15年一、二级融资概览。Source：RNA therapeutics on the rise, 27 April 2020,Nature Reviews Drug Discovery 19, 441-442 (2020),doi:
Figure 9. RNA疗法领域重要企业及相关合作企业。Source：杨若南,许丽,徐萍,等.RNA疗法产业发展态势分析及建议[J].中国生物工程杂志, 2021, 41(2):10.DOI:10.13523/j.cb.2009037.
RNA疗法领先的生物技术公司除获得资本助力外，许多MNC公司同样通过合作研发持续布局，例如由华人科学家何川（Chuan He）教授与Howard Chang教授等人于2018年共同创立Accent Therapeutics，于2020年与AstraZeneca宣布达成了一项价值达11亿美元的合作，双方将合作开发靶向RNA修饰蛋白（RMPs）的转化疗法来治疗多种癌症，并将这种疗法商业化。根据合作协议条款，Accent Therapeutics将负责该项目的临床前研发，直至一期临床试验结束。由AZ主导后续研发和商业化活动 。Accent Therapeutics将获得5500万美元的预付款，并在项目中以期权和里程碑付款的形式获得最高11亿美元的资金，以及在净销售额中获取5%或10%~20%的特许权使用费。
目前RNA疗法通过获批上市证实可应用至罕见病，特别关注神经系统疾病和肝脏疾病，多数属于孤儿药。而美国、欧盟对罕见病药物支付体系的建立与完善吸引了众多资本入局，力求寻找新的增长点。而国内RNA疗法产业处于起步阶段，同时对孤儿药领域开发仍存在政策提升的空间。亟待加强对罕见病研究的研发支持和绿色通道建立。重点突破科研领域中药物稳定性、免疫原性、靶向性、药物体内逃逸率等问题。
RNA疗法毋庸置疑已受到广泛的，不论生物技术企业还是资本市场的注意，随着核酸稳定性增强技术和递送技术的成熟，相信未来会有更多RNA疗法的药物从临床走向应用。但整体RNA疗法在体内除肝脏以外的器官中递送，仍有难点。未来将在多器官靶向方面，突破现有靶向肝脏限制，通过加强生物膜结构和调控规律的研究，提高递送的准确性、进一步提升RNA疗法的药效，监控长期安全性问题。此外，在储存和运输的稳定性方面仍需要持续把控和降低成本。
番外小故事~
全球小核酸药物领军企业Alnylam Pharmaceuticals的离任CEO John Maraganore博士于2022年在Nature发表的《Refections on Alnylam》文章中，回顾在职19年期间企业起起伏伏的发展情况时所提到的，RNA治疗的前景是美好的，但除了技术本身应用的障碍外，公司如何通过IP荆棘丛、完善递送技术、打造强有力的管线、同时保证充足的资金供给同样是一个基于RNA技术的创新型公司需要持续学习并始终报以理性的激情。
尤其在2010年9月RNA技术遭Novartis和Roche的投资冷遇，2011年初New York Times的Andrew Pollack发表题为《“Drugmakers”Fever for the Power of RNA Interference Has Cooled.》，外界对RNAi的看法急转直下的时候，John仍坚定不移坚守RNA疗法，专注打造最优递送的临床管线。在2011年JPM会议中提出新战略“Alnylam 5×15”计划，承诺2015年底前推进5个RNAi药物进入临床阶段。虽然此举也曾遭到团队的质疑，但是结果证明了这一目标的正确。
在2015年底，成功推进了8个项目进入临床。在随后的临床管线推进中，一方面证实了RNAi疗法不仅可应用至罕见病，更可以治疗患者群体更多的适应症，成为了全新的药物类型。同时解决了曾经不可成药的靶点上，成药性的潜力问题，在治疗疾病方面也具备了良好的风险收益比。
2018年Patisiran（商品名：Onpattro）获批上市，证明了Alnylam这个阿拉伯语“一串珍珠”的猎户座腰带中央恒星以信仰闪耀的创新公司商业化的能力。成为了现如今拥有超过1600名员工，累计融资77亿美元的上市公司。
在此引用Nature原文文首中提到的萧伯纳的名言：
The reasonable man adapts himself to the world; the unreasonable one persists in trying to adapt the world to himself. Therefore, all progress depends on the unreasonable man.
“对于当下身处困境中的医药行业来说，更加值得思考。”
Who's John Maraganore
John Maraganore博士出生于芝加哥。2002年至2021年期间担任Alnylam公司的创始人兼首席执行官和董事，创立并领导公司完成了从RNA干扰药物（RNAi）的早期平台研究开始、到临床开发、并在全球获得了世界上前四个RNA干扰药品ONPATTRO®、GIVLAARI®、OXLUMO®和Leqvio®的注册批准和商业化的历程。在Alnylam，他还领导了公司的价值创造战略，创造了250亿美元的市值，包括20多个重要战略合作。
